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熒光定量PCR儀的誤區(qū)

日期：2025-06-21 21:31
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摘要：熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結果準確，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。在實驗技術成熟的今天，也許對你來說，難得不是實驗技術上的問題——而是選擇哪種熒光定量PCR儀——你要征詢實驗室成員的意見、分析實驗室目前乃至將來的需求、平衡實驗室的預算，更要詳細研究各種富誘惑力的宣傳資料。面對各種不同性能的產品，您又該如何選擇呢？ 先建議大走出認識熒光定量PCR的兩個誤區(qū)： 誤區(qū)：儀器通道越多越好 隨著PCR技術的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從初ABI公司推出...
熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結果準確，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。在實驗技術成熟的今天，也許對你來說，難得不是實驗技術上的問題——而是選擇哪種熒光定量PCR儀——你要征詢實驗室成員的意見、分析實驗室目前乃至將來的需求、平衡實驗室的預算，更要詳細研究各種富誘惑力的宣傳資料。面對各種不同性能的產品，您又該如何選擇呢？

先建議大走出認識熒光定量PCR的兩個誤區(qū)：

誤區(qū)：儀器通道越多越好

隨著PCR技術的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個廠都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人不小心走進了“通道越多越好”的誤區(qū)。

在使用有些廠5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結果的性和準確性都要在實驗中使用ROX（種熒光染料）或專用的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也非像宣傳資料**稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。
考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從實驗室實際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復雜化了。

誤區(qū)：real-time PCR儀無需梯度功能

對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度（Tm值），但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件”度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內按照梯度變化，根據結果，步就可以摸索出適合的反應條件。

不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的反應溫度可能有顯著差異，化延伸溫度就顯得很重要。

使用有梯度功能的熒光定量PCR可以次完成以往多次實驗才能完成的化過程，簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗，既節(jié)省實驗時間提效率，又節(jié)省實驗成本。